生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)安裝驗(yàn)證

生物制品質(zhì)量控制中采用的方法包括理化分析方法和生物學(xué)測(cè)定方法，其中理化分析方法的驗(yàn)證原則與化學(xué)制品基本相同，具體驗(yàn)證時(shí)還需結(jié)合生物制品的特點(diǎn)考慮。生物學(xué)測(cè)定系指采用生物學(xué)方法，以反映被測(cè)物的生物學(xué)特性為目的的測(cè)定方法。

（1）生物學(xué)測(cè)定常用方法

生物學(xué)測(cè)定方法可廣泛用于各種檢測(cè)目的，包括鑒別、生物活性和雜質(zhì)檢測(cè)等，其中最主要的是生物活性（或效價(jià)、效力）測(cè)定，生物制品質(zhì)量控制中經(jīng)常采用的方法如下。

①以整體動(dòng)物為試驗(yàn)材料檢測(cè)制品生物活性（或效力）的動(dòng)物試驗(yàn)，一般用于成品檢定。如動(dòng)物保護(hù)力試驗(yàn)，用于疫苗的效力測(cè)定。

②在細(xì)胞水平上測(cè)定產(chǎn)品的生物活性的細(xì)胞測(cè)定試驗(yàn)。常用于各種生物制品的活性(效力)測(cè)定。這類(lèi)方法的變異較大。

③利用酶反應(yīng)速率或免疫相互作用誘導(dǎo)的生物反應(yīng)等方法測(cè)定生物活性的生化檢測(cè)方法。這類(lèi)方法的變異相對(duì)較小,結(jié)果比較準(zhǔn)確。

（2）生物學(xué)檢測(cè)方法驗(yàn)證的范圍

一般情況下，需驗(yàn)證的分析項(xiàng)目有:鑒別試驗(yàn)、純度和雜質(zhì)檢查、原液或制劑中有效成分的含量測(cè)定及生物活性測(cè)定。其他質(zhì)控方法，如必要時(shí)也應(yīng)加以驗(yàn)證。

（3）生物學(xué)檢測(cè)方法驗(yàn)證文件的建立

生物學(xué)測(cè)定方法驗(yàn)證方案中應(yīng)包括驗(yàn)證用樣品的類(lèi)型和數(shù)量、試驗(yàn)設(shè)計(jì)（包括組內(nèi)組間因素)、驗(yàn)證參數(shù)和參數(shù)的可接受標(biāo)準(zhǔn)以及數(shù)據(jù)分析規(guī)范等內(nèi)容。

驗(yàn)證用樣品從日常檢測(cè)該項(xiàng)目的樣品中隨機(jī)選擇，并確保能代表整體物料的特性。樣品制備應(yīng)在驗(yàn)證序列中單獨(dú)進(jìn)行。

生物測(cè)定方法中的某些操作因素（溫度、酸度、培養(yǎng)時(shí)間等）可能導(dǎo)致測(cè)量的組間變異，這些因素通常在研發(fā)階段通過(guò)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（動(dòng)物數(shù)量、稀釋數(shù)量、每個(gè)稀釋度的平行測(cè)定、稀釋間距等）的可接受標(biāo)準(zhǔn)和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析來(lái)進(jìn)行評(píng)估。試驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)考慮測(cè)量流程的所有變異源因素，包括取樣、樣品制備、組內(nèi)和組間因素，使用交叉或嵌套的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)來(lái)揭示變異的重要來(lái)源,保證長(zhǎng)期條件下變異具有代表性。

關(guān)于驗(yàn)證可接受標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)定，如果目前存在質(zhì)量規(guī)范的產(chǎn)品，可接受標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)基于測(cè)量值可能落在產(chǎn)品規(guī)范范圍外的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行判斷和設(shè)定。可使用過(guò)程能力指數(shù)來(lái)獲悉偏差和中間精密度的邊界。中凈環(huán)球凈化可提供生物實(shí)驗(yàn)室、微生物實(shí)驗(yàn)室、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室、凈化工程等的咨詢(xún)、規(guī)劃、設(shè)計(jì)、施工、安裝改造等配套服務(wù)。

生物學(xué)測(cè)定方法驗(yàn)證結(jié)果應(yīng)記錄在驗(yàn)證報(bào)告中。驗(yàn)證報(bào)告應(yīng)支持方法適用于預(yù)期使用目的的結(jié)論或指明糾正行動(dòng)。報(bào)告應(yīng)包括研究的原始數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)學(xué)運(yùn)算。驗(yàn)證數(shù)據(jù)的深入分析包括圖解和統(tǒng)計(jì)摘要,指出驗(yàn)證參數(shù)和他們與目標(biāo)可接受標(biāo)準(zhǔn)的一致性。

（4）生物學(xué)檢測(cè)方法的驗(yàn)證

生物學(xué)性質(zhì)測(cè)定方法驗(yàn)證的主要指南包括:

FDA 工業(yè)指南  生物制品分析規(guī)程及方法驗(yàn)證;

原CFDA CDE 生物制品質(zhì)量控制分析方法驗(yàn)證技術(shù)審評(píng)一般原則。

①專(zhuān)屬性    生物學(xué)測(cè)定方法的專(zhuān)屬性與測(cè)定方法及產(chǎn)品組成密切相關(guān)所以應(yīng)從測(cè)試原理、測(cè)試用材料和供試品組成等方面分析方法的專(zhuān)屬性。

如采用免疫印跡試驗(yàn)進(jìn)行生物制品的鑒別，應(yīng)首先對(duì)所使用抗體的特異性進(jìn)行分析;若供試品中還存在其他組分，則應(yīng)進(jìn)一步驗(yàn)證被檢測(cè)物中其他物質(zhì)能否引起非特異性免疫反應(yīng)。

如采用細(xì)胞測(cè)定方法檢測(cè)生物活性，應(yīng)首先說(shuō)明被測(cè)物質(zhì)與特定的細(xì)胞應(yīng)答之間的相關(guān)性。為表明細(xì)胞測(cè)定方法的特異性，可進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，如加入抗體或特異抑制劑的封閉實(shí)驗(yàn)等。如果成品中加入了可能影響活性測(cè)定的輔料，應(yīng)進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證以排除此種影響。

如采用 ELISA 法檢測(cè)重組產(chǎn)品的殘余宿主蛋白含量，可采用與表達(dá)體系相同的宿主細(xì)胞的蛋白作為免疫原制備抗體，若采用與產(chǎn)品相似工藝進(jìn)行處理后再免疫動(dòng)物，則所獲得抗體的特異性更好。另外，產(chǎn)品中存在的大量目的蛋白可能影響宿主蛋白的測(cè)定，應(yīng)進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證以排除此種影響。

②準(zhǔn)確度    生物制品的生物學(xué)活性為相對(duì)活性，一般與同時(shí)進(jìn)行測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)品/參考品進(jìn)行比較而得，所以應(yīng)對(duì)單位有一個(gè)適當(dāng)?shù)亩x或以適用的標(biāo)準(zhǔn)品/參考品作為對(duì)照經(jīng)計(jì)算而得。為得到準(zhǔn)確的測(cè)定結(jié)果,應(yīng)注意以下幾點(diǎn)。

a.必須同時(shí)測(cè)定供試品和標(biāo)準(zhǔn)品/參考品的劑量反應(yīng)曲線(xiàn)，而且兩條曲線(xiàn)必須具有平行性。

b.應(yīng)盡可能使供試品隨機(jī)分布及保證測(cè)試系統(tǒng)的平衡性。需對(duì)引起系統(tǒng)偏差的某些因素進(jìn)行分析排除，如不同的試驗(yàn)平板、平板的不同位置（如邊緣效應(yīng))、檢測(cè)次序、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的籠子效應(yīng)等。

以相對(duì)效價(jià)測(cè)定方法為例，準(zhǔn)確度驗(yàn)證的范圍應(yīng)包括方法日常使用的范圍;可信賴(lài)的準(zhǔn)確度評(píng)估需要測(cè)定范圍內(nèi)至少3個(gè)效價(jià)水平，推薦5個(gè)效價(jià)水平的評(píng)估;最常用的方式是通過(guò)稀釋標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或已知效價(jià)的樣品獲取目標(biāo)標(biāo)效，這種類(lèi)型的方法經(jīng)常被稱(chēng)為稀釋線(xiàn)性試驗(yàn)。

③精密度    由于各種生物活性測(cè)定方法的變異均較大，所以精密度往往不太理想。

重復(fù)性的驗(yàn)證，建議在期望的濃度范圍內(nèi)至少選取三個(gè)濃度水平，每個(gè)濃度至少應(yīng)測(cè)定5次,求得每個(gè)濃度水平的精密度。

對(duì)于不同測(cè)定方法，其精密度可有較大不同，一般情況下，酶法:小于20%;結(jié)合試驗(yàn):小于20%;細(xì)胞試驗(yàn):小于30%:動(dòng)物試驗(yàn):小于50%。對(duì)于一些尚不成熟的試驗(yàn)方法或某些特殊方法（如珀斑試驗(yàn))，其方法變異可能會(huì)更大些。

④線(xiàn)性    線(xiàn)性關(guān)系一般是指檢測(cè)結(jié)果與樣品含量的直線(xiàn)相關(guān)性，而且一般情況下線(xiàn)性關(guān)系是定量測(cè)定的基礎(chǔ)，所以應(yīng)盡可能摸索出存在較好線(xiàn)性關(guān)系的測(cè)定方法并進(jìn)行線(xiàn)性驗(yàn)證。

線(xiàn)性可以直接對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品、供試品進(jìn)行測(cè)定。為了建立線(xiàn)性關(guān)系，建議至少要用5個(gè)濃度點(diǎn)，每一濃度測(cè)定3次，每次重復(fù)測(cè)定3份，用這些結(jié)果計(jì)算響應(yīng)值與被分析物的濃度的比例關(guān)系,或通過(guò)定義明確的數(shù)學(xué)計(jì)算形成比例關(guān)系。

某些生物活性測(cè)定方法線(xiàn)性范圍較小（如細(xì)胞測(cè)定中呈S曲線(xiàn))，采用曲線(xiàn)擬合的方法應(yīng)更合理。

應(yīng)提供相關(guān)系數(shù)、Y軸上的截距、回歸線(xiàn)的斜率等數(shù)據(jù)，還可以分析實(shí)測(cè)值與回歸線(xiàn)的偏差（離散性)，以助于對(duì)線(xiàn)性作出評(píng)價(jià)。

⑤范圍    具體的范圍一般根據(jù)檢測(cè)的目的而設(shè)定。驗(yàn)證時(shí)所設(shè)定的范圍應(yīng)至少包括了產(chǎn)品規(guī)范中的范圍，如標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定成品生物活性應(yīng)為標(biāo)示量的80 %～120%，則驗(yàn)證的范圍可設(shè)定為標(biāo)示量的70%～130%。

對(duì)于生物制品的生物活性測(cè)定而言，精密度、線(xiàn)性和范圍是非常重要的驗(yàn)證參數(shù)。為減少驗(yàn)證工作的繁雜性，可將范圍研究與精密度、線(xiàn)性研究合并進(jìn)行。

⑥耐用性    由于生物學(xué)測(cè)定結(jié)果對(duì)分析條件往往比較敏感，所以方法的耐用性驗(yàn)證非常重要,根據(jù)具體情況,可針對(duì)關(guān)鍵的參數(shù)進(jìn)行耐用性驗(yàn)證。

耐用性是通過(guò)有效地改變實(shí)驗(yàn)方法的參數(shù)，來(lái)測(cè)定此改變對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，即實(shí)驗(yàn)結(jié)果不受影響的承受程度。在每種試驗(yàn)條件下，對(duì)準(zhǔn)確性、精密性或其他參數(shù)進(jìn)行測(cè)定，以確定試驗(yàn)方法的耐受或承受能力。在研制階段即應(yīng)進(jìn)行耐用性的評(píng)估，它應(yīng)能表明在方法的參數(shù)有微小改變時(shí)該分析方法仍然是可靠的。

⑦檢測(cè)限度和定量限度    對(duì)于已建立的雜質(zhì)檢測(cè)方法，應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)限和定量限驗(yàn)證。檢測(cè)限和定量限可以通過(guò)直觀(guān)法、信噪比法等測(cè)定。

（5）案例分析

下表為相對(duì)效價(jià)測(cè)定方法驗(yàn)證案例,僅供參考。

相對(duì)效價(jià)測(cè)定方法驗(yàn)證案例

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